Au cours du processus de coloration de Gram, cette solution joue le rôle de mordant : elle permet au colorant de pénétrer à l'intérieur de la cellule bactérienne et d'y former un complexe insoluble entre l'iode et le colorant primaire (cristal violet). Ce complexe insoluble reste piégé à l'intérieur de la cellule bactérienne.
Cette rétention du colorant est essentielle pour l'identification des bactéries Gram-positives, dont la paroi cellulaire épaisse permet de conserver le complexe iode-colorant à l'intérieur de la cellule, contrairement aux bactéries Gram-négatives dont la paroi plus fine ne permet pas cette rétention, aboutissant à leur décoloration lors de l'étape suivante du protocole de coloration de Gram.