Le diagnostic du VNO repose généralement sur la détection d'anticorps IgG et IgM spécifiques du virus, dirigés contre les antigènes les plus immunodominants du virus (ENV et NS1), à l'aide de techniques ELISA. Alors que les IgM sont un marqueur d'infection aiguë, les IgG apparaissent plus tardivement au cours de la guérison et de la convalescence. Il est fréquent, dans les tests sérologiques, que des réactions croisées se produisent entre les flavivirus tels que le virus de la dengue, le virus Zika et le virus de l'encéphalite à tiques, même avec les nouveaux tests basés sur des antigènes recombinants ; cela nécessite une certaine prudence lors de l'évaluation des résultats sérologiques des infections à flavivirus.